Příprava preparátu na pozorování
Různé vzorky určené pro různé účely potřebují i různé úpravy či postupy při jejich tvoření. Nejvhodnější na pozorování přes mikroskop je čerstvý materiál bez použití fixativ a barviv z těchto důvodů:
- zůstávají zachovány přirozené barvy pozorovaných struktur,
- dochází pouze k omezené extrakci rozpustných látek jako jsou roztoky obsažené v sekretórnych orgánech nebo buňkách,
- dochází pouze k menšímu poškození přirozených tvarů a velikostí buněk jako při použití jiných metod,
- výsledky a možnost pozorování struktur jsou okamžité.
Postup přípravy preparátu:
- Doporučuje se odebrat více vzorků, protože se může stát, že dojde k znehodnocení, a vy by ste tak o vzorek přišli.
- Pokud budete pozorovat preparáty pro účely vědeckého pokusu, určitě by mělo být sklíčko vždy nové, tedy i čisté. Pokud použijete již použité sklo, to se opláchne nejprve ve vodě saponátem, pak se opláchne 70% etanolem. Po vyčištění bereme sklo do rukou pouze za hrany, abychom nezanechali otisky prstů.
- Na vyčištěné podložní sklíčko pomocí kapátka kápneme do středu kapku montovacího média, v průměru asi 5-7 mm. V cvičení se bude nejčastěji jednat o vodu, ale může to být např. i glycerol apod.
- Do kapky vložíme vhodně upravený objekt (celý orgán, řez, staženou pokožku, atd.) Pomocí štětečku nebo pinzety. V případě nativního preparátu dbáme na to, aby objekt po celou dobu přípravy i vlastního pozorování zůstal živý.
- Krycí sklíčko přiložíme hranou ke kapce média. To se rozteče podél hrany krycího skla. Krycí sklo pak podepřeme na protilehlé straně preparační jehlou, kterou opatrně a pomalu sklápíme krycí sklo tak, aby se v médiu neudělali bubliny. Krycí sklo přitom můžeme přidržovat za hrany mezi palcem a ukazováčkem.
- Zajistíme, aby se objekt mezi krycím a podložným sklíčkem nepohyboval.
- Pokud je část prostoru mezi skly vyplněná vzduchem, je média málo a hrozí nebezpečí vyschnutí pozorovaného objektu. V tomto případě přidáme opatrně kapátkem kapku k hraně krycího skla tam, kde je tekutina a ne vzduch. Tekutina pronikne pod krycí sklo.
- Pokud je média příliš mnoho, krycí sklíčko "plave" a pohybuje se spolu s montovaným objektem. V tomto případě opatrně odsajeme přebytek média ze strany kouskem filtračního papíru nebo buničité vaty.
Důležitá upozornění při přípravě preparátu:
- Pokud jsou v preparátu bubliny, je obvykle nutné jej přemontovat. "Vypuzování" bublin obvykle nevede k žádoucímu cíli.
- Krycí sklíčko musí být menší než podložní a má ležet stejně jako objekt přibližně uprostřed podložního sklíčka.
- Před mikroskopu zajistíte, aby ani stoleček mikroskopu ani spodek podložního skla nebyly vlhké. Stejně nesmí být médium na krycím sklíčku.
Příprava vzorku pro elektronovou mikroskopii
- Důležitým předpokladem je, že preparát nebude obsahovat vodu. V elektronovém mikroskopu je preparát vystaven vakuu, díky kterému by se voda v preparátu uvolňovala. Díky uvolněné vodě by mohlo dojít hned k několika problémům. Prvním by bylo znehodnocení preparátu, druhým problémem by pak byl fakt, že by uvolněná voda zpomalovala elektrony.
- Preparát by stejně neměl překročit velikost 100 nm. Kdyby byl preparát silnější, elektrony by přes něj jednoduše neprošly. Když už by se jim to přece jen podařilo, poskytovaly by příliš zkreslený a nepřesný obraz.
- U přípravy preparátu pro elektronovou mikroskopii začneme vyříznutím vhodné velikosti preparátu z jiného, většího. Oříznutí se provádí zásadně skalpelem. Pokud se bude jednat o buňky, musíme je fixovat různými roztoky v různém složení. Důležitou roli hraje i pH (kyselost). Jak bylo zmíněno v bodě 1, ze vzorku třeba odvázat vodu.
- Dehydratace preparátu probíhá pomocí acetonu. Ten se naředí na různé koncentrace, a buňka se do něj jednoduše ponoří. Takto upravené vzorky pak fixujeme pomocí propylenoxidu. Buňky (tkáň) se přelije do syntetické pryskyřice, následuje polymerace. Po těchto úpravách vzorek ořežeme na ultramikrotomu. Tyto řezy jsou již připraveny na sledování v elektronovém mikroskopu.
Příprava mikroskopů
1. Stav mikroskopu
Před pozorováním je třeba připravit nejen preparát, ale také mikroskop. První věc, která by se měla zjistit, je stav mikroskopu. Zjistit, zda je v pořádku okulár a čočky. Tyto nesmí být prasklé nebo jinak poškozené, mohli by zkreslovat výsledky.
2. Čistota pracovního stolku
Musí být zajištěna čistota pracovního stolku. Když by byl stolek jakýmkoliv způsobem znečištěný, mohlo by dojít i ke kontaminaci a následnému znehodnocení preparátu.
3. Kontrola zdrojů osvětlení
Další důležitou věcí, před zahájením sledování je kontrola zdrojů osvětlení. U zrcadlových mikroskopů se musí dbát na čistotu zrcadla, stejně tak by zrcadlo nemělo být prasklé. Od prasklin by se světlo neodráželo přímo do okuláru, a sledovací podmínky by tak byly značně zhoršené. U LED osvětlení pak zkontrolujeme, zda jsou diody v pořádku. Halogenové zdroje pak vyžadují kontrolu zářivosti.
4. Čistota prostředí a nástrojů
Ať už se bude jednat o přípravu preparátů nebo mikroskopů, vždy dbejte především na čistotu prostředí a nástrojů, stejně tak jako na preciznost. S precizní připraveným preparátem a mikroskopem jste potom schopni pozorovat a zkoumat vzorky přesnější a detailnější.